前言

在国家重大仪器研制项目的支持下，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心研制临床单细胞拉曼药敏快检仪CAST-R，并通过星赛生物进行产业化推广。基于原创的临床快检思路，CAST-R通过与北京协和医院、青岛大学附属医院、浙江大学医学院附属邵逸夫医院等的密切合作，开发和示范了针对血液、口腔护理等样品类型或场景的临床药敏快检流程，并进行了较为系统与深入的临床样品测试。通过与原创RAGE-Seq技术的结合，CAST-R能够在细胞群体或群落中，全面地揭示“谁”（病原的种类鉴定）在“干什么”（病原的药敏性），以及“为什么”（耐药机制）。

抗生素滥用与误用造成了耐药性广泛传播，“超级病菌”已成为本世纪人类健康的主要威胁之一。作为遏制耐药性传播与精准用药的前提与关键，临床药敏/耐药快检技术长期没有突破。由于无法摆脱病菌的培养与纯化过程，现有方法通常耗时至少2~3天，对于尚难培养或生长缓慢的病菌更是无能为力，无法满足临床精准用药要求。同时，耐药传播防控要求单细胞水平的病原“表型-基因型”追踪，而现有手段却通常只能精确到“细胞群体”水平（~6个数量级的精确度差距）。因此，开发新一代的临床药敏/耐药快检技术与装备体系刻不容缓。

对此，基于前期的科研成果，青岛能源所单细胞中心在国家重大仪器研制项目支持下，成功研制临床单细胞拉曼药敏快检仪CAST-R，并通过星赛生物进行产业化推广。在中科院科技服务网络计划（STS计划）的支持下，CAST-R陆续完成成套技术示范与转移服务。

基础研究，迸发临床快检新思路

针对临床药敏快检，青岛能源所单细胞中心发明了重水标记单细胞拉曼药敏快检技术（D₂O-Ramanometry）（点击查看）。这是一种临床药敏检测的崭新原理：当代谢活跃的细胞利用氘标记的水（重水）时，氘原子会参与细胞脂质合成过程形成C-D键并替换原有的C-H键，这一变化可通过拉曼定量检测出来，且氘峰替换率（C-D Ratio）与细胞代谢活性线性相关。因此，通过比较抗生素处理下的细菌C-D Ratio变化，检测细胞的代谢活性强弱，可以实现细菌药敏性的快速定量。

D₂O-Ramanometry技术在单个细菌细胞精度、直接检测药物作用下的“代谢活性”，让处于“NGMA (Non-Growing but Metabolically Active)”状态的细胞无所遁形。单细胞中心基于此提出了全新的药敏性检测指标——基于代谢活性的最低抑菌浓度（MIC-MA指数）。MIC-MA即药物作用一定时间后，基于C-D峰检测的“全部”细胞（一定拉曼组取样深度下检测的每一个细胞）的代谢活性“彻底”被抑制的最低药物剂量。对于特定病菌和特定抗菌药物，MIC-MA与传统MIC数值存在显著不同。研究发现，即便在高达60倍MIC的氨苄西林剂量时，仍然存在高比例的“NGMA”状态的变形链球菌细胞，这导致在抗生素压力消失时病菌“星火燎原”，发生复发性感染。因此，MIC-MA在评价抗菌药效是否“够快、够准、够狠”等方面，与目前临床上普遍参照的MIC相比，具有鲜明的特色与显著的优势。

在以替加环素治疗败血症为模型，研究血流感染中常见病原体药敏性检测的研究中，单细胞中心提出了“eMIC-MA”概念，以有效排除菌株起始状态和仪器改变对检测结果的影响。研究人员测试了100株鲍曼不动杆菌临床分离株对替加环素的药敏性，与临床金标准（微量肉汤稀释法；BMD）相比较的基本一致率和分类一致率分别为99%和93%，从而验证了CAST-R的准确性和可靠性。针对26例患者血培养阳性培养瓶，测定了常见血流感染菌对替加环素、美罗培南、头孢他啶和氨苄西林/舒巴坦等8种抗生素的药敏性，并与BMD结果相比，分类一致率达到93%，验证了CAST-R在血流感染用药上的广谱适用性。

基于上述基础研究，单细胞中心研制出首台单细胞拉曼药敏快检仪（CAST-R）。CAST-R的单细胞拉曼光谱模块，通过检测反映细胞重水利用速率（即代谢活性）的氘峰，三小时之内可定量药敏/耐药性；同时，基于细胞拉曼全谱的动态变化以及病菌拉曼组参照数据库，能够初步鉴定微生物种类并区分药物应激机制。此外，CAST-R整合了拉曼激活单细胞分选与单细胞核酸提取扩增等环节，可以高通量快速测定与上述特定耐药表型相对应的单细胞基因型（16SrDNA基因和全基因组）。CAST-R将直接支撑主要威胁病原的临床耐药性快检，同时也为菌群原位耐药性微进化机制研究提供崭新工具。

拓展应用，加速仪器熟化

基于星赛生物的临床单细胞拉曼药敏快检仪CAST-R，通过与北京协和医院、青岛市立医院、青岛大学附属医院、浙江大学医学院附属邵逸夫医院等临床团队的密切合作，开发和示范了针对血液、口腔护理等样品类型或场景的临床药敏快检流程，并进行了较为系统与深入的临床样品测试。

血液感染菌的CAST-R临床示范

与北京协和医院检验科合作开展“血液感染菌CAST-R临床示范”。针对血瓶报阳样品，已建立临床血液样品的预处理流程，实现从报阳血瓶切入的药敏检测。设置传统培养方法作为对照，对临床样品中主要的临床耐药菌建立重水孵育体系，进行病原菌种类识别、药敏检测，并最终形成药敏检测报告。针对血瓶报阳样品，CAST-R与传统方法相比，药敏结果一致性达94%，实现3小时快速药敏检测（比传统方法快了5~10倍）。这一结果证明了CAST-R在败血症等急性血液感染检测上的应用价值，发表于mLife《微生物》（点击查看） 。

细菌药敏精确测量的CAST-R示范

与浙江大学附属邵逸夫医院合作开展“细菌药敏精确测量CAST-R示范”。目前研究细菌耐药产生和传播机制的一个技术问题是，相当多的基因组突变引起的药敏性变化较为微弱，因此急需能够灵敏、精确地检测药敏性变化的方法。工作人员研究发现，MDR-AB（多重耐药鲍曼不动杆菌）的rrf和rpoB突变体中MIC值的增加相当小，常规方法难以量化如此细微的差别；但是利用CAST-R，却可以揭示其耐药性显著高于野生型，从而证明在抑制浓度的替加环素时，抗性表型与存活率直接相关。该研究成果说明在测量细胞耐药表型上，CAST-R比传统方法更快，并且更加灵敏，结果发表于Emerging Microbes & Infections《新发病原体及感染》（点击查看）。

口腔感染护理的CAST-R临床示范

与青岛市立医院口腔中心合作开展“口腔感染护理CAST-R临床示范”。牙髓及根尖周组织内的微生物感染可引起牙髓炎、根尖牙周炎甚至持续炎症反应，因此在口腔根管治疗过程中，根管冲洗液的消毒效果评价和选择至关重要。我们将CAST-R首次应用于根管冲洗液抑菌效能的评价中，实现了主要细菌和真菌的抑菌效果精准评价，并筛选出抑菌性强且对口腔细胞副作用低的消毒液配方。这项工作初步展示了CAST-R除了临床药敏检验之外，在抑菌药物筛选方面的巨大应用价值。该工作成果发表于Frontiers in Cellular and Infection Microbiology《细胞与感染微生物学前沿》（点击查看）和Journal of Raman Spectroscopy《拉曼光谱学》（点击查看） 。

单细胞拉曼全面揭示“谁”在“干什么”以及“为什么”

次序式单细胞拉曼分选技术RAGE

为了实现拉曼测量后特定细胞的分选，CAST-R可嵌入RAGE分选平台。基于单细胞拉曼表型，次序式地将单个目标微生物，选择性的包裹进单个液滴中，并将其单独精准地导出至芯片外，进行下游的单细胞分析工作，如靶基因验证、全基因组测序等。“次序式”的设计能够保证单细胞拉曼表型与基因组序列的对应。该技术能够在细胞群体或群落中，全面地揭示“谁”（病原的种类鉴定）在“干什么”（病原的药敏性）。

基于上述模块，CAST-R完成了临床尿液样本中单个尿道感染大肠杆菌细胞的拉曼药敏测量和与之耦合的分选测序工作。借助于得到的完整测序数据（全基因组覆盖率>95%），研究人员从单细胞基因组中寻找出氨苄西林、链霉素等完整而精确的耐药基因谱。相关成果发表于Small（点击查看） 。

单细胞全基因组扩增与耐药机制分析

对于微生物的单细胞扩增来说，现阶段最常用的方法是MDA。我们推出了酶催化效率更高，扩增偏好性及非特异性扩增更低的单细胞全基因组扩增试剂盒产品，并完成迭代研发。该试剂盒可覆盖细菌、真菌、动物、植物原生质体等多种类型样品，打破了进口试剂的技术壁垒，使用性能与国外成熟试剂盒产品相当。目前，已申请发明专利2项，服务广西科学院及扬州大学开展相关科研项目研究。

对单细胞全基因组数据的分析，可进一步确认细菌的耐药性及耐药程度，判断是否存在多重耐药，并可进一步挖掘耐药表型背后的耐药突变机制。单细胞基因组数据分析流程、单细胞基因组数据在线分析系统等软件的推出，可服务耐药基因和耐药相关突变的鉴定及进化分析，提高数据分析的易用性和效率。

总结

药敏快检是精准用药、控制耐药性传播的前提与保障，其关键挑战是免培养、临床菌适用、快速代谢表型测量、耐药基因型探究和仪器化。星赛生物的临床单细胞拉曼药敏快检仪CAST-R，基于重水标记单细胞拉曼光谱技术（D₂O-Ramanometry）、MIC-MA/eMIC-MA概念，实现了自动化的样本预处理、细胞精准定位、高质量拉曼图谱采集、质控及分析，并可耦合下游单细胞测序，建立基于拉曼组的药敏表型与基因型的关联，在完成快速、准确、可靠的临床药敏检测的同时，探究耐药机制并跟踪超级细菌的出现与耐药性的传播。CAST-R的应用场景在持续拓展中，星赛生物有望在临床感染治疗中贡献中国力量！