在生物制造领域，“高产”始终是科研人员和企业追求的核心目标。但一个困扰行业多年的难题的是：即便基因完全相同的克隆细胞，生产效率也会天差地别，有的是“高产能手”，有的却“消极怠工”。

近日，英国帝国理工学院团队在 Nature Communications 发表重磅研究，首次构建标准化单细胞代谢分析框架，精准捕捉到克隆细胞群中代谢亚群的分化规律，破解了生物生产“异质性魔咒”，为行业从“经验驱动”向“数据与机制驱动”升级，提供了全新可行的路径。

为何“同款细胞”，产量差一倍？

微生物细胞工厂是生产色素、药物前体等高价值化合物的核心工具，但其“表型异质性”一直是行业瓶颈——基因序列完全一致的克隆细胞，会因代谢状态差异，自发分化为高产、低产两个亚群。

传统解决方案要么依赖复杂的基因改造，要么靠反复筛选高产细胞，不仅成本高、耗时久，还会消耗细胞自身资源，普适性极差。

研究团队意识到，要破解这一困境，关键在于实现“单细胞水平的代谢与产物关联分析”：只有看清单个细胞的代谢状态，找到高产细胞的“特征标签”，才能精准优化生产效率。

3大发现，揭开代谢亚群的神秘面纱

YTK-ScBiosense工具包的构建与验证（原文Fig. 1）。所有传感元件均可稳定表达，且能特异性响应靶向代谢物的变化。该工具包解决了传统单细胞质谱分析灵敏度低、成本高的瓶颈，实现对单细胞代谢状态的稳健表征，可直接用于后续代谢亚群的筛选与分析，为整个研究搭建了核心技术平台。

mNeon 感知构建体功能验证（原文Fig. 2）。针对检测胞内 pH（PHi）和 NADPH 水平的 pHluorin2 和 pYRE-mNeon 感知构建体，通过弱有机酸（Fig. 2A）或二酰胺处理验证其功能（Fig. 2B）。针对生长响应型传感单元，将 pRPL28-mNeon、pRPL31B-mNeon 或 pHXT5-mNeon 表达菌株培养至饱和状态，记录生长曲线各时间点的生长速率和信号变化。pRPL28-mNeon 的信号变化与生长速率呈正相关（Fig. 2C）。针对 pGPD2-mNeon 感知构建体，我们将其克隆至野生型（WT）和 gpd1Δgpd2Δ 敲除（KO）菌株中。结果显示，pRPL28-mNeon 的信号变化与生长速率呈正相关(Fig. 2E）。针对 mNeon-FBPs 感知构建体，通过将葡萄糖预培养的细胞转移至以葡萄糖或丙酮酸为碳源的培养基中进行验证。丙酮酸转移组细胞的 mNeon-FBPs 信号虽初始下降，但随后稳步升高，转移 5 小时后较葡萄糖转移组高 65%；作为阳性对照的 2.6 C45-HHRz 呈现类似趋势（Fig. 2D）。针对 ATP 感知构建体，将在乙醇中预培养的 pRS425-PercevalHR、PercevalHR、yAT1.03 表达菌株用呼吸抑制剂抗霉素 A（antimycin A）处理进行验证。处理后，PercevalHR 和 yAT1.03 的传感信号较处理前基线分别降低 1.69 倍和 1.19 倍 —— 这与乙醇培养细胞主要依赖呼吸产生能量，处理后丧失 ATP 维持能力的预期一致（Fig. 2F、G）。

发现1：葡萄糖耗竭，是亚群分化的“触发器”

急性或渐进性葡萄糖耗竭（碳饥饿），是克隆细胞群分化为不同代谢亚群的关键原因。以酿酒酵母为研究对象，在碳饥饿条件下，细胞会稳定分化为两种核心胞内pH（pHi）亚群：

- p1亚群（低pHi）：占比20%-40%，代谢活性低，应激响应更显著；

- p2亚群（高pHi）：占比60%-80%，呼吸代谢活跃，生存和增殖能力更强。

更关键的是，这种亚群分化源于“表型异质性”，而非自发基因突变——将分选后的p1、p2亚群重新培养，它们仍会分化为两类细胞，且不会出现跨亚群转换的现象。

发现2：亚群生产能力，有“产物依赖性”

这是研究最具应用价值的发现：两个亚群的高产特性并非“一刀切”，而是与目标产物高度相关，而胞内pH（pHi），就是区分高产/低产的“天然标志物”：

- 紫罗酮生产：低pHi的p1亚群是“高产能手”，72小时后产物积累量较p2亚群高82%，且仅p1亚群能检测到紫罗酮的自发荧光；

- 番茄红素生产：高pHi的p2亚群表现更优，其番茄红素含量是p1亚群的3.71倍，而混合群体的产量，比纯p2亚群低40%。

发现3：简单调控碳源，就能“定向提升”产量

既然亚群比例直接影响产量，研究团队进一步探索了调控方法，发现了一个低成本、易落地的策略：切换碳源。

在番茄红素生产中，将碳源从葡萄糖替换为半乳糖，可使低产的p1亚群占比从69.8%降至31.6%，番茄红素产量直接提升1.94倍（达2.12 mg·L⁻¹）。更重要的是，这一效应在深孔板、微生物反应器等不同规模的培养体系中均稳定存在，为工业放大提供了清晰的路径。

代谢对环境变化（葡萄糖耗竭）的响应（原文Fig. 3）。将细胞从丰富的 YPD 培养基转移至 10 种不同培养基条件，包括氮源充足（SMD）和氮源限制（NLIM_PRO、NLIM_GLN、NLIM_UREA、NLIM_NH4）、发酵偏好型（YPD、SMD）与呼吸偏好型（YPEtOH、SMEtOH）、碳饥饿条件（CSTRAVE），以及雷帕霉素抑制 TOR 信号通路（RAPA）。急性和渐进性葡萄糖耗竭（CSTRAVE、SMEtOH）是克隆细胞群中代谢亚群分化的关键触发因素（Fig. 3A-B）。仅在这两种条件下，Dip 检验的统计量（Dn）显著升高，细胞群体出现明显的双峰分布，分化为p1（低pHi，约占20%-40%）和p2（高pHi，占60%-80%）两个核心亚群（Fig. 3C）。进一步验证显示，p1、p2亚群表型稳定，15小时内无细胞跨亚群转换（Fig. 3D），重新接种后仍会分化为两类亚群，证实其分化源于表型异质性，而非自发基因突变（Fig. 3F）。

胞内 pH 亚群是产物异质性的来源（原文Fig. 4）。将 pHluorin2 引入紫罗酮（Fig. 4A）或番茄红素（Fig. 4B）生产途径的菌株中，在模拟分批发酵条件的摇瓶中进行培养。用荧光流式方法检测细胞内的紫罗酮含量，拉曼流式方法检测细胞内番茄红素含量（Fig. 4C）。两种微生物细胞工厂在摇瓶分批发酵 24 小时后均出现完全分化的亚群，并在整个培养过程中持续存在（Fig. 4D）。① 紫罗酮生产中，低pHi的p1亚群是高产亚群，72小时后p1亚群的紫罗酮自发荧光信号较p2亚群高82%（Fig. 4E-F），显微镜成像显示，自发荧光仅存在于p1亚群，p2亚群几乎无紫罗酮积累（Fig. 4G）；② 番茄红素生产中，高pHi的p2亚群表现更优，拉曼光谱检测显示，p2亚群的番茄红素特征峰面积是p1亚群的3.71倍，p1亚群颜色更浅（近乎无色），混合群体的番茄红素产量较p2纯群体低40%（Fig. 4H-I）。

通过理性培养策略调控亚群动态（原文Fig. 5）。为探索半乳糖作为碳源的潜力，在深孔板中培养番茄红素生产菌株，分别以 2% 半乳糖或 2% 葡萄糖作为碳源，分析亚群动态和番茄红素产量。在番茄红素生产菌株中，葡萄糖培养时低产的p1亚群占比高达69.8%，换用半乳糖作为碳源后，p1亚群占比降至31.6%，p2（高产）亚群占比显著提升（Fig. 5A、E）。与此同时，番茄红素产量从1.09 mg·L⁻¹提升至2.12 mg·L⁻¹（提升1.94倍），单位生物量产量从0.021 mg·g⁻¹提升至0.035 mg·g⁻¹（Fig. ）。该调控效应在深孔板、微生物反应器及pH缓冲条件下均稳定存在，证实碳源调控亚群比例的可靠性，为该技术的工业规模化应用提供了关键数据支撑。

拉曼光谱，助力单细胞产物精准定量

值得注意的是，番茄红素无明显自发荧光，无法通过传统荧光传感器检测，而批量检测会掩盖亚群差异，难以验证p2亚群的高产特性。

研究中，以星赛生物的FlowRACS为基础的单细胞拉曼光谱技术发挥了核心作用——通过靶向番茄红素的特征峰（1000 cm⁻¹、1148 cm⁻¹、1508 cm⁻¹），实现了单细胞水平的产物直接定量，精准区分了p1、p2亚群及混合群体的产量差异，为亚群特性的验证提供了直接证据，也完善了“代谢状态传感-亚群分选-产物定量”的完整技术闭环。

全球协作赋能：助力 iMAPS 计划，推动微生物组资源共享

当前，单细胞原位代谢图谱科学计划（iMAPS；www.iMAPS.info） 正在全球建设 70 余个微生物组代谢功能探测节点，旨在规模化、系统性地产出海量拉曼组 / 元拉曼组大数据，构建原位功能菌种库。本研究采用的单细胞拉曼光谱技术，同属 iMAPS 计划倡导的拉曼组 / 元拉曼组核心技术体系。

本研究是 iMAPS 五大板块中生物制造 / 合成生物学领域的重要应用范例，更为生物制造过程中的代谢异质性追踪与理性调控提供了一个可复制、可借鉴的研究思路与技术路径。

从实验室到工厂，搭建高效转化桥梁

该研究不仅从理论上揭示了生物生产异质性的核心原因——葡萄糖耗竭驱动的代谢亚群分化，更从技术上提供了一套可落地的解决方案：

1.  开发的YTK-ScBiosense工具包，为单细胞代谢分析提供了标准化方案，可推广至大肠杆菌、毕赤酵母等多种微生物细胞工厂；

2.  碳源调控策略无需复杂基因改造，成本低、易落地，可直接应用于工业生产，帮助企业快速突破产量瓶颈；

3.  确立了胞内pH作为高产细胞的“天然标志物”，结合拉曼光谱等技术，为后续高产菌株筛选、发酵工艺优化提供了精准方向。

总体而言，这项研究打破了人们对克隆细胞“同质化”的认知，将单细胞代谢分析从基础研究推向工业应用，为生物制造行业的高效、稳定发展，注入了全新的动力。