微藻能够利用二氧化碳和光能合成油脂、色素、多糖等高附加值化合物，是碳中和背景下极具潜力的"细胞工厂"。但一个长期存在的瓶颈是：以微拟球藻为例，超过一半的预测基因至今功能未知，这严重限制了人们对其代谢机制的解析和后续的理性改造。
怎样快速把基因组里这些"功能暗物质"对应到具体的代谢功能，一直是个难题。
瓶颈 1 ：传统诱变文库是 “基因型黑箱”
常规化学或物理诱变因为突变位点随机、往往为多位点突变等，通常难以快速追溯突变，造成机制解析困难。
瓶颈 2：高通量代谢表型筛选存在显著局限
传统微藻高通量代谢表型筛选主要基于荧光流式，然而荧光流式由于叶绿素荧光的干扰和荧光标记底物有限导致其应用范围极为受限。
因此，亟需一个单细胞精度、免荧光标记、高效建立代谢表型组与相应基因型关系的技术平台。在本研究中星赛生物的FlowRACS成为整套方案的核心硬件支撑。
双模块硬核平台：CRISPR 全基因组文库 + FlowRACS 拉曼流式分选
Figure 1. 传统方法（A）与本研究方法（B）从突变体库中高通量挖掘功能基因的流程对比
文库规模：覆盖 2397 条有效 gRNA，构建 3567 株微拟球藻单基因突变株，基因组突变分布均匀，无基因偏好；
基因型可追溯：依托 gRNA 作为分子标签，通过高通量 NGS 快速定位每株突变体靶基因，彻底告别传统文库 “黑箱”，实现 “基因型白箱”；
突变优势：85.4% 为移码失活突变，可稳定获得基因功能缺失株，覆盖光合作用、色素合成、蛋白降解等全通路基因；
开源资源：全部验证 gRNA 上传 NanDeSyn 数据库，面向全球藻类科研共享。
Figure 2. 用于真核微藻全基因组 CRISPR/Cas 单基因敲除的质粒文库的构建与评估
Figure 3. 真核微藻全基因组 CRISPR/Cas 单基因敲除文库的构建与评估
Figure 4. 真核微藻全基因组 CRISPR/Cas 单基因敲除文库的特征分析
微藻类胡萝卜素在 1509 cm⁻¹ 存在专属共振拉曼特征峰，不受叶绿素背景干扰，峰强与胞内总类胡萝卜素含量线性相关（R²＞0.98），无需提取、无需染色，单细胞直接定量
超高通量 + 长时间稳定运行
分选速度可达 600 细胞 / 分钟，连续 5 小时信号无漂移，分选准确率 95.97%、细胞回收率 73.70%；仅需数小时即可从数万突变细胞中分选出排名前 1% 的类胡萝卜素高产单细胞
无损活细胞分选
全程无荧光、无化学染色，分选后细胞完整，可直接用于 MDA 全基因组扩增、NGS 测序，实现 “单细胞表型→靶基因” 直接溯源
广谱通用性
不局限微藻，细菌、真菌、动植物、哺乳动物细胞均可适配，覆盖油脂、多糖、色素、药物中间体等各类代谢产物筛选
Figure 5. 基于单细胞拉曼光谱从真核微藻全基因组 CRISPR/Cas 单基因敲除文库中免标记、高通量地筛选类胡萝卜素高产相关基因
传统平板 - 培养 - HPLC 筛选需要数周，本平台单日完成全部筛选流程，效率提升数十倍。
通过三轮独立 FlowRACS 分选富集，研究共鉴定109 个类胡萝卜素高产相关突变基因，覆盖类胡萝卜素生物合成、光合作用等20余条代谢通路。其中不仅包括已知的类胡萝卜素合成相关基因，如紫黄质脱环氧酶，还发现了此前从未与色素代谢关联的基因——蛋白酶体组装伴侣蛋白4（noPAC4）。
noVDE（紫黄质脱环氧酶）：阻断叶黄素循环，定向富集紫黄质
弱光条件下，紫黄质含量提升 30% 以上，总类胡萝卜素显著累积；
机理：noVDE 负责强光下紫黄质向玉米黄质转化，敲除后转化通路阻断，紫黄质持续积累；
产业价值：为高纯度紫黄质规模化生产提供明确基因编辑靶点。
Figure 6. noVDE 敲除微拟球藻突变体的基因型与表型
创新发现：noPAC4 通过双重通路全局提升多种类胡萝卜素
表型优势：敲除 noPAC4 后，紫黄质、玉米黄质、β- 胡萝卜素同步显著提升，光合效率 Fv/Fm 同步上调；
双层全新调控机制（转录 + 翻译后双重调控）：表观遗传层面：抑制组蛋白去乙酰化酶 HDAC 表达，上调整条类胡萝卜素合成通路转录水平；蛋白稳态层面：削弱 26S 蛋白酶体功能，减少类胡萝卜素合成相关蛋白泛素化降解，提升叶绿体中类胡萝卜素合成相关蛋白的丰度，拉动碳流向色素合成；
应用前景：单一基因敲除即可同步提高多种高价值类胡萝卜素，是工业藻株改造最优靶点之一。
Figure 7. noPAC4 敲除微拟球藻突变体的基因型、表型及转录组动态变化
Figure 8. 海洋微拟球藻中类胡萝卜素合成的调控机制图
1. 基础科研价值：破解基因组功能 “暗物质”
超过半数微生物、藻类、植物基因无同源注释，传统同源预测无法挖掘全新代谢通路。本正向遗传学平台不依赖基因序列同源性，仅通过单细胞代谢表型反向锁定功能基因，为未知基因功能解析提供通用范式。
2. 合成生物学产业价值：大幅缩短底盘藻株开发周期
无需大规模分批培养、无需代谢物提取，降低人力与耗材成本；
稀有高产突变株不会在传代中丢失，大幅提升优良藻株筛选成功率；
可拓展筛选油脂、DHA、虾青素、药用蛋白等各类光合产物。
3. FlowRACS 仪器差异化优势（星赛生物自研国产设备）
FlowRACS 融合微流控介电分选与自发拉曼光谱，同时解决无标记、高通量、长时间稳定、活细胞回收四大痛点，是国内唯一实现商业化量产的高通量拉曼流式分选设备，已服务国内多所顶尖院所与生物企业。
该平台将基因功能挖掘从依赖先验同源性假设的"猜基因"模式，升级为直接从代谢表型反向定位基因型的"表型驱动"全新范式，为高效解析功能未知基因提供了关键技术支撑。未来，将该体系进一步拓展至其他高值代谢物（如虾青素、DHA、淀粉等）及更多物种（细菌、真菌、植物、动物细胞），结合AI驱动的拉曼组数据库，有望实现从单细胞拉曼"指纹"直接预测基因型-表型关联，迈向真正高通量、低成本的细胞工厂理性设计。
作为专注于单细胞功能表型解析与功能细胞分选装备研发的创新企业，星赛生物长期深耕拉曼组学与单细胞技术，以"测得快、判得准、量得清、用得上"为核心能力，持续为微生物育种、合成生物学、细胞工厂构建、功能基因挖掘等前沿科研场景提供硬核技术与装备支撑。
鲁公网安备37021202001515
